使命召唤ol加速器|使命召唤ol删掉的模式
歡迎訪問北京德博生物技術有限公司官方網站!

流式細胞術

流式細胞術概述
流式細胞術(Flow Cytometry)是七十年代發展起來的高科學技術,它集計算機技術、激光技術、流體力學、細胞化學、細胞免疫學于一體,是一種對處在液流中的細胞或 其他生物微粒,以及人工合成微球逐個進行多種物理或生物學特征快速定量分析和分選的技術。它不僅可測量細胞大小、內部顆粒的性狀,還可檢測細胞表面和細胞 漿抗原、細胞內DNA、RNA含量等,可對群體細胞在單細胞水平上進行分析,在短時間內檢測分析大量細胞,并收集、儲存和處理數據,進行多參數定量分析; 能夠分類收集(分選)某一亞群細胞,分選純度>95%。
對比起其他技術方法,流式細胞術擁有其明顯的特點和優勢,因而在血液學、免疫學、腫瘤學、藥物學、分子生物學等學科廣泛應用。
(1) 快速地細胞分析
(2) 以單一細胞為基礎
(3) 定量性熒光分析
(4) 相關性多參數分析
(5) 無需細胞分離步驟
(6) 可分選有關細胞,進行培養或再分析

流式細胞術發展簡史

1934年,Moldavan1首次提出了使懸浮的單個血紅細胞等流過玻璃毛細管,在亮視野下用顯微鏡進行計 數,并用光電記錄裝置計測的設想,在此之前,人們還習慣于測量靜止的細胞,因為要使單個細胞順次流過狹窄管道容易造成較大的細胞和細胞團塊的淤阻。 1953年Crosland–Taylor根據雷諾對牛頓流體在圓形管中流動規律的研究認識到:管中軸線流過的鞘液流速越快,載物通過的能力越強,并具有 較強的流體動力聚集作用。于是設計了一個流動室,使待分析的細胞懸浮液都集聚在圓管軸線附近流過,外層包圍著鞘液;細胞懸浮液和鞘液都在作層液。這就奠定 了現代流式細胞術中的液流技術基礎。
1956年,Coulter在多年研究的基礎上利用Coulter效應生產了Coulter 計數器。其基本原理是:使細胞通過一個小孔,只在細胞與懸浮的介質之間存在著導電性上的差異,便會影響小孔道的電阻特性,從而形成電脈沖信號,測量電脈沖 的強度和個數則可獲得有關細胞大小和數目方面的信息。1967年Holm等設計了通過汞弧光燈激發熒光染色的細胞,再由光電檢測設備計數的裝置。1973 年Steinkamp設計了一種利用激光激發雙色熒光色素標記的細胞,既能分析計數,又能進行細胞分選的裝置。這樣就基本完成了現代FCM計數技術的主要 歷程。
現代的FCM數據采集和分析技術是從組織化學發源的,其開拓者是Kamentsky。1965年,Kamentsky在組織化學 的基礎上提出了兩個新設想:(1)細胞的組分是可以用光光度學來定量測定的,即分光光度術可以定量地獲得有關細胞組織化學的重要信息。(2)細胞的不同組 分可以同時進行多參數測量,從而可以對細胞進行分類。換句話說,對同一細胞可以同時獲得有關不同組分的多方面信息,用作鑒別細胞的依據。 Kamentsky不僅思路敏捷,而且能身體力行。他是第一個把計算機接口接到儀器上并記錄分析了多參數數據的人,也是第一個采用了二維直方圖來顯示和分 析多參數的人。
流式細胞術在細胞化學中的應用的先驅者是Van Dilla和美國的Los Alamos小組。他們在1967年研制出流液束、照明光軸、檢測系統光軸三者相互正交的流式細胞計的基礎上,首次用熒光Feulgen反應對DNA染色 顯示出DNA的活性與熒光之間存在著線性關系,并在DNA的直方圖上清楚地顯示出細胞周期的各個時相。Gohde 和Dittrich接著把這項技術推向實用,他們用流式細胞術測定細胞周期借以研究細胞藥代動力學問題。FCM用于免疫組織化學中的關鍵是對細胞進行免疫 熒光染色,其它和在細胞化學的應用并沒有多大差異。
近20年來,國內外在FCM上都做了不少的研究和應用工作,也取得了不少成果。特別 是隨著儀器和方法和日臻完善,人們越來越致力于樣品制備、細胞標記、軟件開發等方面的工作以擴大FCM的應用領域和使用效果。FCM在免疫組織化學中的應 用也大致差不多,并注重了在臨床應用的推廣
流式細胞儀
1. 流式細胞儀概述
流 式細胞儀(Flow Cytometer,FCM)是流式細胞術的主要設備。它是通過測量細胞及其他生物顆粒的散射光和標記熒光強度,來快速分析顆粒的物理或化學性質,并可以 對細胞進行分類收集的高精密儀器。流式細胞儀可以高速分析上萬個細胞,并能同時從一個細胞中測得多個細胞特征參數,進行定性或定量分析,具有速度快、精度 高、準確性好等特點。




圖1:BD公司臨床型流式細胞儀FACSCalibur
國內使用的流式細胞儀主要由美國的兩個廠家Beckman-Coulte公司(產品如EPICS ALTRA和EPICS XL/XL-MCL)和Becto n-Dickinson公司(產品如FACS Vantage、FACS Calibur 和FACS Canto等)生產。流式細胞儀主要有兩三類:(1)臨床型(又稱小型機、臺式機),其特點是儀器的光路調節系統固定,自動化程度高,操作簡便,易學易掌 握。(2)綜合型(又稱大型機、分析型),其特點是分辨率高,可快速將所感興趣的細胞分選出來,并可以將單個細胞或指定個數的細胞分選到特定的培養孔或培 養板上,同時可選配多種波長和類型的激光器,適用于更靈活的科學研究。(3)新型流式細胞儀,隨著激光技術的不斷發展,儀器選用多根激光管,多時可同時檢 測十幾個熒光參數。還可以實現高速分選,速度達到50000個/每秒。通過激光技術與顯微拍攝技術的結合,產生了更新的圖象流式細胞技術和儀器(如 Amnis公司的ImageStream System),可以得到更多的參數和實驗效果,極大地滿足了科學研究的需要。

流式細胞儀主要技術指標:
(1)流式細胞儀的分析速度:一般流式細胞儀每秒檢測1000~5000個細胞,大型機可達每秒上萬個細胞。
(2)流式細胞儀的熒光檢測靈敏度:一般能測出單個細胞上<600個熒光分子,兩個細胞間的熒光差>5%即可區分。
(3)前向角散射(FSC)光檢測靈敏度:前向角散射(FSC)反映被測細胞的大小,一般流式細胞儀能夠測量到0.2μm~0.5μm。
(4)流式細胞儀的分辨率:通常用變異系數CV值來表示,,一般流式細胞儀能夠達到<2.0%,這也是測量標本前用熒光微球調整儀器時要求必須達到的。
(5)流式細胞儀的分選速度:一般流式細胞儀分選速度>1000個/秒,分選細胞純度可達99%以上。
2. 流式細胞儀主要構造和工作原理
流動室及液流驅動系統
流式細胞儀主要由以下五部分構成:①流動室及液流驅動系統;②激光光源及光束形成系統;③光學系統;④信號檢測與存儲、顯示、分析系統;⑤細胞分選系統。
流動室(Flow Cell或Flow Chamber)是流式細胞儀的核心部件,流動室由石英玻璃制成,單細胞懸液在細胞流動室里被鞘流液包繞通過流動室內的一定孔徑的孔,檢測區在該孔的中 心,細胞在此與激光垂直相交,在鞘流液約束下細胞成單行排列依次通過激光檢測區。流動室里的鞘液流是一種穩定流動,控制鞘液流的裝置是在流體力學理論的指 導下由一系列壓力系統、壓力感受器組成,只要調整好鞘液壓力和標本管壓力,鞘液流包繞樣品流并使樣品流保持在液流的軸線方向,能夠保證每個細胞通過激光照 射區的時間相等,從而使激光激發的熒光信息準確無誤。
流式細胞儀可配備一根或多根激光管,常用的激光管是氬離子氣體激光管,它的發射光波長488nm,此外可配備氦氖離子氣體激光管(波長633nm)和/或紫外激光管。
流式細胞儀的主要測定信號熒光是由激發光激發的,熒光信號的強弱與激發光的強度和照射時間相關,激光是一種相干光源,它能提供單波長、高強度、高穩定性的光照,正是能達到這一要求的理想的激發光光源。
在激光光源和流動室之間有兩個圓柱形透鏡,將激光光源發出的橫截面為圓形的激光光束聚焦成橫截面較小的橢圓形激光光束(22μm×66μm),在這種橢圓形激光光斑內激光能量成正態分布,使通過激光檢測區的細胞受照強度一致。
光學系統和信號檢測系統
流 式細胞儀的光學系統由若干組透鏡、小孔、濾光片組成,大致可分為流動室前和流動室后兩組。流動室前的光學系統由透鏡和小孔組成,透鏡和小孔(一般為2片透 鏡、1個小孔)的主要作用是將激光光源發出的橫截面為圓形的激光光束聚焦成橫截面較小的橢圓形激光光束,使激光能量成正態分布,使通過激光檢測區的細胞受 照強度一致,最大限度的減少雜散光的干擾;流動室后的光學系統主要由多組濾光片組成,濾光片的主要作用是將不同波長的熒光信號送到不同的光電倍增管。濾光 片主要有三類:長通濾片(LP)—只允許特定波長以上的光線通過,短通濾片(SP)—只允許特定波長以下的光線通過,帶通濾片(BP)—只允許特定波長的 光線通過,不同組合的濾片可以將不同波長的熒光信號送到不同的光電倍增管(PMT),如接收綠色熒光(FITC)的PMT前面配置的濾光片是LP550和 BP525,接收色橙紅色熒光(PE)的PMT前面配置的濾光片是LP600和BP575,接收紅色熒光(CY5)的PMT前面配置的濾光片是LP650 和BP675。
圖3 流式細胞儀光學系統和信號檢測系統示意圖
當測定標本在鞘流液約束下細胞成單行排列依次通過激光檢測區時產生散射光和熒光信號,散射光分為前向角散射(Forward Scatter, FS)和側向角散射或90度散射(Side Scatter,SS)。散射光是細胞的物理參數,與細胞樣本的制備(如染色)無關;熒光信號也有兩種,一種是細胞自發熒光它一般很微弱,一種是細胞樣本 經標有特異熒光素的單克隆抗體染色后經激光激發發出的熒光,它是我們要測定的熒光,熒光信號較強,這兩種熒光信號的同時存在是我們測定時需要設定陰性對照 的理由,以便從測出的熒光信號中減去細胞自發熒光和抗體非特異結合產生的熒光。
前向角散射(FS)反映被測細胞的大小,它由正對著流動室的光電二極管裝置接收并轉變為電信號;側向角散射或90度散射(SS)反映被測細胞的細胞膜、細 胞質、核膜的折射率和細胞內顆粒的性狀,它由一個光電倍增管(PMT)接收并轉變為電信號,這些電信號存儲在流式細胞儀的計算機硬盤或軟盤內。
流式細胞儀測定常用的熒光染料有多種,他們分子結構不同,激發光譜和發射光譜也各異,選擇熒光染料時必須依據流式細胞儀所配備的激光光源的發射光波長(如 氬離子氣體激光管,它的發射光波488nm,氦氖離子氣體激光管發射光波長633nm)。488nm激光光源常用的熒光染料有FITC(異硫氰酸熒光 素)、PE(藻紅蛋白)、PI(碘化丙啶)、CY5(化青素)、preCP(葉綠素蛋白)、ECD(藻紅蛋白-得克薩斯紅)等。他們的激發光和發射光波長 分別是:




各種熒光信號由各自的光電倍增管(PMT)接收并轉變為電信號后存儲在流式細胞儀的計算機硬盤或軟盤內.見圖光學系統和信號檢測系統示意圖。
信號存儲、顯示、分析系統
(一) 信號存儲
存儲在流式細胞儀的計算機硬盤或軟盤內的數據一般是以List mode(列表排隊)方式存入的,采用List mode方式有兩大優點:①節約內存和磁盤空間 ②易于加工處理分析。
(二)信號顯示和分析
由于List mode方式數據缺乏直觀性,數據的顯示和分析一般采用一維直
方圖(圖5)、二維點陣圖(圖6)、等高線圖(圖7)和密度圖(圖8)。
1. 單參數數據顯示和分析:細胞的每一個單參數測量數據用直方圖來顯示,圖中橫坐標表示散射光或熒光信號相對強度值,其單位是道數,可以是線性的,也可以是對 數的;縱坐標表示細胞數。見圖5一維直方圖,圖中橫坐標是PE熒光信號相對強度值(對數),縱坐標表示細胞數;根據實驗者設定的“門”(直線門),儀器的 計算機就會給出測定值(包括陽性細胞%和平均熒光強度)。
2. 雙參數數據顯示和分析:細胞的雙參數測量數據和細胞數量的關系用一維直方圖、二維點陣圖、等高線圖和密度圖顯示和分析。如圖4的二維點陣圖,是正常人外周 血白細胞的前向散射光(FS)和側向散射光(SS)組成的點陣圖,橫坐標和縱坐標均是線性的,圖中淋巴細胞、單核細胞、粒細胞很明顯地分為3群,可以很容 易地圈“門”(Bitmap,無定型門),分析各亞群細胞的數據。圖6二維點陣圖是細胞的兩種熒光(PE-Cy5和Alexa405-A)雙參數數據顯 示,橫坐標代表PE-Cy5,縱坐標代表Alexa405-A,圖中已設定適當的“門”(十字門),十字門的D1、D2、D3、D4門分別代表 Alexa405-A單陽性細胞、PE-Cy5和Alexa405-A雙陽性細胞、陰性細胞、PE-Cy5單陽性細胞。儀器的計算機就會給出兩種熒光測定 值(包括陰性細胞%、兩種熒光各自的陽性細胞%、兩種熒光的雙陽性細胞%、各群細胞的平均熒光強度)。圖7和圖8分別是測定細胞的兩種熒光雙參數數據的密 度圖和等高線圖,橫坐標和縱坐標分別代表一種熒光參數,同理只要設定十字門就可得到兩種熒光的各種測定值,密度圖和等高線圖較點陣圖更直觀。
3.三參數數據顯示和分析:細胞的三參數測量數據和細胞數量的關系每兩個數據組成一對(三參數測量數據和細胞數量每兩個數據可組成6對數據)用一維直方 圖、二維點陣圖、等高線圖和密度圖顯示和分析。三個熒光數據關系用分光圖(prism)表示,分光圖可直接給出8個數據(如用ABC代表3種熒光,可有 A+B+C+、A+B+C-、A+B-C-、A-B+C+、A-B+C-、A-B-C+、A+B-C+、A-B-C-)。

圖8 密度圖
細胞分選系統
如在細胞流動室上裝有超聲壓電晶體,通電后超聲壓電晶體發生高頻震動,可帶動細胞流動室高頻震動,使細胞流動室噴咀流出的液流束斷成一連串均勻的液滴, 每秒鐘形成液滴上萬個。每個液滴中包含著一個樣品細胞,液滴中的細胞在形成液滴前已被測量,如符合預定要求則可被充電,在通過偏轉板的高壓靜電場時向左 或向右偏轉被收集在指定容器中,不含細胞液滴或細胞不符合預定要求液滴不被充電亦不發生偏轉進入中間廢液收集器中,從而實現了分選。分選的詳細原理和 操作請有興趣者參考有關文獻。


0512-62512025

使命召唤ol加速器