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免疫膠體金標記抗體及檢測抗原

基本原理
 
膠體金在光鏡和電鏡中均為有效的標記物,可以檢測單一和多重抗原。膠體金在電解質中不穩定,但被蛋白質包被的膠體金是穩定的。一般常用免疫球蛋白或蛋白A包被膠體金,可作標記二抗進行免疫檢測,本方法應用范圍廣,染色后的樣品可以長期保存。
 
試劑和設備
l         超速離心機
l         顯微鏡
l         溫箱
l         分光光度計
l         0.2 um 微孔濾膜
l         載玻片,蓋薄片,濾紙
l         氯金酸鈉
l         1% 檸檬酸鈉水溶液
l         山羊抗鼠Ig抗體
l         對T淋巴細胞特異的鼠抗人單克隆抗體
l         自人外周血分離的白細胞懸液
l         10%氯化鈉
l         1% 聚乙二醇
l         0.01mol/L pH7.2的PBS
l         1% 戊二醛乙醇溶液
l         50%硝酸銀溶液(提前一天配制)
l         明膠顯影液,2g明膠溶解于99ml蒸餾水中,加1 ml甲酸
 
操作步驟
 
(一) 膠體金溶液制備
1.稱取0.1g 氯金酸鈉,溶解于1L去離子水中;
2.加熱煮沸,劇烈攪拌下,迅速加入25ml新配的1%檸檬酸鈉溶液;
3.繼續煮沸5分鐘,至溶液變成桔紅色;
4.用蒸餾水將溶液的525 nm波長下的光密度吸收值調到 0.8。
(二) 膠體金的包被
1.  將山羊抗鼠Ig抗體以 36 900 ′g 離心30分鐘;
2.  上清液經0.2 nm 濾膜過濾;
3.  確定蛋白質包被的最佳濃度:將蛋白質作連續10倍稀釋各1ml,加入5ml膠體金溶液,1分鐘后加入1ml 10%氯化鈉溶液,靜止5分鐘;以膠體金溶液為空白對照測定光吸收度,選擇最低吸收值的蛋白質濃度用于正式包被。
4.  取50ml膠體金溶液,用0.2M K2CO3調pH值為7.6,按照確定的最佳比例將蛋白質加入并快速混合,讓蛋白質吸附2分鐘后,加0.5ml 1%聚乙二醇,防止非特異性凝集;
5.  5000′g 離心1小時,棄上清液,將膠體金懸浮于含 1% 聚乙二醇的 PBS中;重復一次;
6.  棄去上清液,將包被的膠體金溶液用5 ml含1% BSA的PBS稀釋, 經微孔濾膜過濾后,4℃保存。
(三) 抗原檢測
1.  取20ul人外周血白細胞與5ml T淋巴細胞特異的單克隆抗體在4℃下孵育30分鐘;
2.  1000 r/分離心清洗細胞5分鐘,2次;
3.  將洗滌后的細胞與20ml(一般效價1:20)膠體金標記的山羊抗鼠Ig抗體在室溫下孵育30-60分鐘;
4.  1000 r/分離心清洗細胞5分鐘,2次;
5.  將細胞涂片于載玻片,用1% 戊二醛固定細胞10分鐘,清洗多余固定液;
6.  將載玻片細胞面向上置于放有濕潤濾紙的培養皿中,加4滴50%硝酸銀溶液和2滴明膠顯色液,覆以蓋玻片,放入60-65℃的溫箱中,顯色3-4分鐘,直至玻片標本呈現金褐色為止;
7.  移出蓋玻片,用蒸餾水迅速漂洗數秒,晾干;
8.  光學顯微鏡下觀察。
 
對照試驗
 
  可以用未加一抗的細胞作為對照試驗組。
 
試驗要點及說明
 
1.  所使用的器皿均應非常潔凈,需經過硅烷化處理;
2.  使用高純度多次蒸餾去離子水;
3.  膠體金顆粒的形成、大小和速度,均決定膠體溶液的穩定性,水質和玻璃表面對啟動還原和穩定膠體十分重要,本過程制備的膠體金顆粒直徑約為18-20 nm;
4.  因為膠體金在電解質中不穩定,本實驗全部操作過程要嚴格、迅速,注意液體顏色;
5.  蛋白質包被膠體金時的相對最佳濃度要事先測定,測定最佳濃度時,膠體金溶液的pH值也要調節到pH7.6;
6.  一抗和膠體金標記二抗的稀釋濃度應事先經預試驗以最佳效價。

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