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Western Blot問題指南(二)

O. 我要檢測的目的蛋白是分子量大概為42kd的膜蛋白,膜蛋白提取可不可以不用到超速離心機,有沒有直接用低溫高速離心機就可以的提到膜蛋白的方法,42kd的蛋白分子量算不算大?

解答:如是需要提取膜蛋白,(而不是只需要提取膜蛋白),可以用Ripa buffer提取膜蛋白和胞漿蛋白,用這個做Western Blot就可以了。如果是非要只提取膜蛋白就要用到超速離心機。42kd 不算大,也不算小,所以,可以按照一般的轉移方法實施。

P. 蛋白的上樣量有沒有什么具體的要求?

解答:上樣量要根據實驗的要求來定, 如果要求是定量和半定量的Western Blot 則上樣量要均等, 如果只是要定性,則沒有太大的關系,盡量多上就行了, 但是不要超過0.3μg/mm2。

Q. 一抗,二抗的比例是否重要?

解答:比較重要,調整好一抗,二抗的比例,可以去掉部分非特異的本底。

3. 抗體

R. 做細胞信號傳導,要做磷酸化某因子Western Blot,其二抗有何要求?

解答:對二抗無要求,要看你實驗條件來選擇,一般推薦用HRP標記的二抗。

S. 同一公司的另外抗體用這個稀釋度做出來效果很好,所以沒做預試,怕費時間,用什么樣的稀釋度比較好呢?我用的ELL+plus試劑盒顯色。轉膜過夜,一抗孵育也是過夜的,若封閉也過夜的話就要四天才看的到結果了。

解答:不同抗體,即使是同一公司的抗體,其最佳的抗體稀 釋度也是不一樣的,需要你實驗摸索。我覺得轉膜過夜好像沒有必要吧,轉膜的目的也就是將蛋白轉到膜上就行啦,何必浪費時間呢。至于具體的轉膜時間,還要看你的目的蛋白分子量的大小;轉膜的設備,是半干式,還是濕式。一抗當然可以過夜,如果你想所短 Western Blot時間的話,可以增高一抗的孵育溫度,我們實驗室一般37度,兩小時就足夠了;你可以參照抗體說明書。至于一抗和二抗得稀釋度,你可以一抗 1:1500;二抗1:20000試試。另外建議你洗膜時,多洗幾次,最好是在封閉;一抗和二抗后至少是5x5min,跑一張好膜不容易,多盡點心吧,這 樣不會浪費你的時間,只會節省你的時間!

T. 免疫組化和Western Blot可以用同一種抗體嗎?

解答:免疫組化時抗體識別的是未經變性處理的抗原決定簇 (又稱表位),有些表位是線性的,而有的屬于構象型;線性表位不受蛋白變性的影響,天然蛋白和煮后的蛋白都含有;構象型表位由于受蛋白空間結構限制,煮后變性會消失。如果你所用的抗體識別的是蛋白上連續的幾個氨基酸,也就是線性表位,那么這種抗體可同時用于免疫組化和Western,而如果抗體識別構象形表位,則只能用于免疫組化。一般抗體說明書上都有注明此種抗體識別的氨基酸區間。(限于單抗)

U. Western Blot 中抗體的重復應用問題

解答:抗體工作溶液一般不主張儲存反復使用,但是如抗體比較珍貴,可反復使用2-3次。稀釋后應在2-3天內使用,4度保存,避免反復凍融。

4. 濾紙、膠和膜的問題

V. NC膜 PVDF膜 尼龍膜怎樣鑒別?

解答:尼龍膜是較理想的核酸固相支持物,有多種類型;硝酸纖維素膜是目前應用最廣的一種固相支持物,價格最便宜;PVDF膜介于二者之間。就結合能力而言:尼龍膜結合DNA和RNA能力可達480-600μg/cm2,可結合短至10bp的核酸片段;硝酸纖維素膜結合DNA和RNA能力可達80-100μg/cm2,對于200bp的核酸片段結合能力不強;PVDF膜結合DNA和RNA能力可達125-300μg/cm2。就溫度適應性而言:尼龍膜經烘烤或紫外線照射后,核酸中的部分嘧啶堿基可與膜上的正電荷結合;硝酸纖維素膜依靠疏水性相互作用結合DNA,結合不牢固;PVDF膜結合牢固,耐高溫,特別適合于蛋白印跡。就韌性而言:尼龍膜較強;硝酸纖維素膜較脆,易破碎;PVDF膜較強。就重復性而言:尼龍膜可反復用于分子雜交,雜交后,探針分子可經堿變性被洗脫下來;硝酸纖維素膜不能重復使用;PVDF膜可以重復使用。

W. 在做Western Blot時,PBDF膜用甲醇浸泡的目的?

解答:PVDF膜用甲醇泡的目的是為了活化PVDF膜上面的正電基團,使它更容易跟帶負電的蛋白質結合,做小分子的蛋白轉移時多加甲醇也是這個目的。

X. 檢測磷酸化的JNK 和非磷酸化的JNK可以在同一張膜上嗎?
解答:可以。

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