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免疫共沉淀實驗成功3大關鍵

一、個人總結的成敗因素:

1. 有效裂解細胞。

2. 恰當選擇處理樣本的方式:超聲或酶處理。

3. 選用適當適量抗體。

4. 恰當設置對照。

5. 不要過分交聯DNA-蛋白質。

6. 交聯所用的甲醛終濃度約為1%,交聯時問需要預實驗來確定。

7 . 注意PCR策略具體來說:恰當設置ChIP實驗對照,設置適當的陽性和陰性對照是進行ChIP結果分析的重要步驟和Trouble shooting的依據,因為非特異性的免疫沉淀難以避免。

一般的設置方法

1 未經免疫沉淀的超聲處理后樣本( INPUT)。

2 加特異抗體來源動物的正常血清或無關抗體(MOCK)。

3 陽性對照引物的應用。

4 選擇不與目的蛋白質結合的基因組區域作對照。

如 陽性對照抗體 (Anti-acetyl-Histone H3)

* 陰性對照抗體 (Normal Rabbit IgG)

* PCR引物 (control primer specific for human GAPDH)

二 、抗體選擇,盡可能選擇試劑公司驗證過的CHIP級抗體,如upstate公司。

與目的蛋白比,抗體應過量,預實驗確定抗體用量,選用高質量高滴度抗體。

抗體識別位點不是DNA-Pro結合的位點。

三、ChIP耗時長,什么時候能夠停止并且冷凍樣本?

I. 甲醛固定和沖洗以后離心下形成的細胞球狀聚合體。

II. 細胞溶液(lysate)。

III. 聲波裂解染色質后。

IV. 在逆轉交聯后。

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